xem bóng đá số

    1. Thu thập mô tươi và lưu trữ ở -20 ° C.
    2. Mô hình lá xem bóng đá sốo một loại bột mịn với nitơ lỏng trong một vữa prechills [vữa cửa hàng và chày ở -20 ° C hoặc -80 ° C].
    3. Transfer ground tissue with a chilled paintbrush into a well-chilled, 50-ml polypropylene tube and store at -20°C.Không để bột tan.Tất cả các công cụ nên được làm lạnh xem bóng đá số nitơ lỏng.
    4. Thêm natri bisulfite vào bộ đệm chiết và điều chỉnh xem bóng đá số với 5N NaOH đến 7,8 .88.0. Đun nóng bộ đệm chiết đến 65 ° C và thêm 15 trận20 ml đến 10 Ném15 ml mô đông lạnh. Trộn đều.
Bộ đệm trích xuất xem bóng đá số
cho 1 l [Final]
5M NaCl
100.0 ml
500 mm
1M TRIS-HCL xem bóng đá số 8.0
100.0 ml
100 mm
0,5M EDTA xem bóng đá số 8.0
100.0 ml
50 mm
20% SDS
62,5 ml
0,84% (w/v)
Mang đến khối lượng cuối cùng với nước cất vô trùng.Lưu ý:Thêm 0,38 g natri bisulfite/bộ đệm chiết 100 ml ngay trước khi sử dụng và điều chỉnh xem bóng đá số đến 7,8.
  1. ủ trong bể nước 65 ° C trong 30 xem bóng đá sốút; Đảo ngược các ống cứ sau 5 xem bóng đá sốút10.
  2. Thêm chloroform: isoamyl cồn [24: 1 v/v] xem bóng đá sốo đầu ống và trộn mạnh mẽ.
  3. ly tâm 15 xem bóng đá sốút tại 4.500 vòng / xem bóng đá sốút. Chuyển pha trên vào một ống 50 ml mới bằng cách đổ qua 2 lớp
  4. Thêm 2 thể tích (lấp đầy ống vào trên) của lạnh [-20 ° C] 95% EtOH và trộn nhẹ nhàng để kết tủa DNA. Đặt ở -20 ° C trong 30 xem bóng đá sốút60 xem bóng đá sốút.
  5. Đổ EtOH 95%, rửa với 70% ETOH tươi và thêm 30 ml EtOH lạnh 70%. Trộn nhẹ nhàng trong vài xem bóng đá sốút. DNA có thể được để lại vô thời hạn trong 70% EtOH [có thể để lại qua đêm ở -20 ° C].
  6. Tua lại với 70% ETOH mới nếu DNA vẫn bị đổi màu. Hủy bỏ DNA bằng cách móc nó trên pipet Pasteur và xóa bỏ ETOH 70% với Kimwipe. Chuyển DNA xuống dưới cùng của ống vi ống 1,5 ml vô trùng. Nếu thực hiện nhiều lần khai thác, DNA ướt ly tâm nhẹ nhàng, sau đó đảo ngược ống vài xem bóng đá sốút để cho chất lỏng thoát ra. DNA khô tại RT trong 2 giờ 3 giờ.
  7. Hòa tan xem bóng đá số trongvô trùngTE [0.5 Từ1 ml tùy thuộc vào kích thước viên]. Ủ trong bể nước 65 ° C cho đến khi hòa tan với sự đảo ngược nhẹ nhàng cứ sau 30 đến 60 xem bóng đá sốút hoặc cho đến khi DNA được hòa tan [có thể mất vài giờ].
  8. ly tâm 10 xem bóng đá sốút trong microcentrifuge ở 13.000 vòng / xem bóng đá sốút để loại bỏ bất kỳ vật liệu nào không đi vào dung dịch.
  9. Xác định nồng độ DNA bằng cách tách độ pha loãng 1:20 [1 DNA: 20 TE: 1 dung dịch đệm tải] trên gel agarose cùng với các dấu hiệu (DNA Lambda không cắt ở nồng độ 10, 20, 50 và 80 ng). Gel vết bẩn với 0,5 μg/ml ethidium bromide trong 15 xem bóng đá sốút và chụp ảnh. So sánh trực quan cường độ của các dải DNA với các điểm đánh dấu để xác định nồng độ.