xem bóng đá số
- Thu thập mô tươi và lưu trữ ở -20 ° C.
- Mô hình lá xem bóng đá sốo một loại bột mịn với nitơ lỏng trong một vữa prechills [vữa cửa hàng và chày ở -20 ° C hoặc -80 ° C].
- 30593_30710Không để bột tan.Tất cả các công cụ nên được làm lạnh trong nitơ lỏng.
- Thêm natri bisulfite vào bộ đệm chiết và điều chỉnh xem bóng đá số với 5N NaOH đến 7,8. Đun nóng bộ đệm chiết đến 65 ° C và thêm 15 trận20 ml đến 10 Ném15 ml mô đông lạnh.
| cho 1 l | [Final] | |
|---|---|---|
| 5M NaCl |
100.0 ml
|
500 mm
|
| 1M TRIS-HCL xem bóng đá số 8.0 |
100.0 ml
|
100 mm
|
| 0,5M EDTA xem bóng đá số 8.0 |
100.0 ml
|
50 mm
|
| 20% SDS |
62,5 ml
|
0,84% (w/v)
|
|
Mang đến khối lượng cuối cùng xem bóng đá số nước cất vô trùng.Lưu ý:Thêm 0,38 g natri bisulfite/bộ đệm chiết 100 ml ngay trước khi sử dụng và điều chỉnh xem bóng đá số đến 7,8.
|
||
- ủ trong bể nước 65 ° C trong 30 xem bóng đá sốút; Đảo ngược các ống cứ sau 5 xem bóng đá sốút10.
- Thêm chloroform: isoamyl cồn [24: 1 v/v] xem bóng đá sốo đầu ống và trộn mạnh mẽ.
- ly tâm 15 xem bóng đá sốút tại 4.500 vòng / xem bóng đá sốút. Chuyển pha trên vào một ống 50 ml mới bằng cách đổ qua 2 lớp
- Thêm 2 thể tích (lấp đầy ống vào trên) của lạnh [-20 ° C] 95% EtOH và trộn nhẹ nhàng để kết tủa DNA. Đặt ở -20 ° C trong 30 xem bóng đá sốút60 xem bóng đá sốút.
- Đổ EtOH 95%, rửa với 70% EtOH tươi và thêm 30 ml ETOH lạnh 70%. Trộn nhẹ nhàng trong vài xem bóng đá sốút.
- Tua lại với 70% ETOH mới nếu xem bóng đá số vẫn bị đổi màu. Hủy bỏ xem bóng đá số bằng cách móc nó trên pipet Pasteur và xóa bỏ ETOH 70% với Kimwipe.
- Hòa tan xem bóng đá số trongvô trùngTE [0.5 Từ1 ml tùy thuộc vào kích thước viên]. Ủ trong bể nước 65 ° C cho đến khi hòa tan với sự đảo ngược nhẹ nhàng cứ sau 30 đến 60 xem bóng đá sốút hoặc cho đến khi DNA được hòa tan [có thể mất vài giờ].
- ly tâm 10 xem bóng đá sốút trong microcentrifuge ở 13.000 vòng / xem bóng đá sốút để loại bỏ bất kỳ vật liệu nào không đi vào dung dịch.
- Xác định nồng độ DNA bằng cách tách độ pha loãng 1:20 [1 DNA: 20 TE: 1 dung dịch đệm tải] trên gel agarose cùng với các dấu hiệu (DNA Lambda không cắt ở nồng độ 10, 20, 50 và 80 ng). Gel vết bẩn với 0,5 μg/ml ethidium bromide trong 15 xem bóng đá sốút và chụp ảnh.