Cấy nuôi cấy 2 ml trong ống kaput từ một thuộc địa duy nhất và đặt nó trên máy lắc 37 ° C qua đêm.
Cấy nuôi cấy 400 ml trong bình 1 L bằng cách đổ nền văn hóa 2 ml vào bình; tỷ số bóng đá olympic ủ 4 đến 5 giờ ở 37 ° C trong khi lắc.
Thu hoạch các tế bào bằng cách ly tâm trong 10 phút tại 6.000 vòng / phút ở 4 ° C. Decant phần nổi phía trên và đặt ở một góc trên băng để tỷ số bóng đá olympic chất lỏng còn lại thoát ra khỏi viên.
Resuspend các viên trong 5 ml dung dịch I (glucose 50 mM, 25 mM Tris tỷ số bóng đá olympic 8,0, 10 mM EDTA); và chuyển nuôi cấy vào ống ly tâm đa bào nalgene 50 ml.
Thêm 10 ml dung dịch II (O.2 N NaOH, 1 % SDS), ống phủ bằng parafilm và nhẹ nhàng đảo ngược để trộn; tỷ số bóng đá olympic giải pháp được đặt trên băng trong 10 phút.
Thêm 7,5 ml dung dịch III (3 m Naac tỷ số bóng đá olympic 4.8), ống tỷ số bóng đá olympicủ bằng parafilm và trộn bằng cách đảo ngược nhẹ nhàng.
ống ly tâm ở mức 12.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 ° C, đổ phần nổi trên ống 50 ml thứ hai, thêm isopropanol 11 ml, phủ parafilm và trộn bằng cách tăng nhẹ tỷ số bóng đá olympic ống thoát trong 10 phút, lypholize đến gần khô;
Thêm 4,7 g CCCL và 0,4 ml dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong TE (mật độ của mẫu là từ 1,55 đến 1,59 g/mL đã sử dụng).
32211_32364
ống ly tâm ở 20 ° C ở 65.000 vòng / tỷ số bóng đá olympicút trong 4 giờ hoặc 55.000 vòng / tỷ số bóng đá olympicút qua đêm.
Tháo dải plasmid khỏi ống bằng kim và ống tiêm, và chuyển sang ống 1,5 ml.
Thêm 1 thể tích isopropanol bão hòa (trộn thể tích bằng isopropanol và 20 x ssc pH 7.0) và trộn đều. Ly tâm, hoặc tỷ số bóng đá olympic đứng trong vài phút.
Lặp lại việc trích xuất 4 đến5 lần hoặc tỷ số bóng đá olympic đến khi màu hồng trong propanol biến mất.
Pha mẫu DNA với 2 thể tích TE, thêm 1/10 thể tích 3M NAAC tỷ số bóng đá olympic 7 và trộn đều.
Thêm 2 tập 95% ethanol và trộn đều.
ly tâm trong 5 tỷ số bóng đá olympicút, ống thoát nước, rửa sạch các viên và các mặt của ống với 70% ethanol, thoát ethanol và làm khô viên.
33237_33351
Thêm một thể tích bằng nhau của dung dịch 1: 1: dung dịch chloroform, trộn đều, ly tâm một cách ngắn gọn và chuyển pha trên sang ống khác.
Thêm một khối lượng chloroform bằng nhau, trộn đều, ly tâm một cách ngắn gọn và chuyển pha trên sang một ống khác.
Kết tủa DNA với 3 m Naac và ethanol và hòa tan viên trong 400 Laul Te.
Xác định nồng độ DNA bằng cách sử dụng máy quang tỷ số bóng đá olympicổ hoặc bằng điện di trên minigel.