Phân lập DNA bộ gen thực vật cho bộ gen tỷ số bóng đá tây ban nha lai tạo tại chỗ (GISH)

1. Nghiền 5 g mô lá tỷ số bóng đá tây ban nha nitơ lỏng (không để vật liệu thực vật tan băng) và đổ bột vào bình 250 ml.
2. 30605_30727
   • 2 x CTAB Buffer là 1,4 M NaCl, 100 mM Tris pH 8.0, 2% CTAB (hexadecyltrimethylamonium bromide), 20 mM EDTA, 0,5% na bisulfide, 1% 2-mercaptoethanol (2-ME).
   • Khi tạo bộ đệm CTAB, nên thêm NaCl sau các thành phần khác ngoại trừ 2-ME tỷ số bóng đá tây ban nha dung dịch. Không thêm 2-me cho đến khi ngay trước khi sử dụng.
   • Giải pháp không có 2-Me có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng.
3. Để các bình nguội nhiệt độ đến nhiệt độ phòng, thêm cloroform 15 ml/cồn isoamyl (24: 1) và xoáy bình cho đến khi một nhũ tương được hình thành (đặt bình vào máy lắc quay tỷ số bóng đá tây ban nha 15 phút ở nhiệt độ phòng).
4. Đặt mẫu vào ống ly tâm và quay ở 10.000 vòng / phút tỷ số bóng đá tây ban nha 15 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Chuyển phần nổi phía trên vào một ống sạch và thêm 2/3 thể tích rượu isopropyl; Đảo ngược các ống nhiều lần;
6. rửa viên DNA hai lần với 70% ethanol. Đổ ethanol ra và để viên không khí khô tỷ số bóng đá tây ban nha 1 h.
   Thêm 500 PhaL của TE và chuyển DNA vào ống 1,5 ml; Thêm 5 PhaL RNase A (10 mg/ml) và để lại ở 4 ° C qua đêm hoặc ở 37 ° C tỷ số bóng đá tây ban nha 1 h.
7. Thêm 500 Phal phenol, trộn đều và quay tỷ số bóng đá tây ban nha 5 phút; Chuyển phần nổi phía trên sang một ống khác.
8. Thêm 250 PhaL mỗi phenol và chloroform, trộn đều và quay tỷ số bóng đá tây ban nha 5 phút; Chuyển phần nổi phía trên sang một ống khác.
9. Thêm 500 Chloroform, trộn đều và quay tỷ số bóng đá tây ban nha 5 phút; Chuyển phần nổi phía trên vào ống 10 ml.
10. Thêm TE vào thể tích cuối cùng là 3 ml, sau đó thêm khối lượng 1/10 NAAC 3 M và 2 tập ethanol 100%. Đảo ngược ống nhiều lần.
11. Rửa tỷ số bóng đá tây ban nha kết tủa hai lần với 70% ethanol; Chuyển DDNA vào ống 1,5 ml;
    • Theo quy định, tỷ số bóng đá tây ban nha bộ gen càng làm sạch, đầu dò có nhãn biotin tốt hơn. Do đó, tỷ số bóng đá tây ban nha bị cô lập có thể được tinh chế thêm bằng cách sử dụng quy trình lọc CSCL.
12. Xác định nồng độ tỷ số bóng đá tây ban nha bằng cách sử dụng máy quang phổ hoặc bằng điện di trên minigel.