Chuẩn bị và thanh lọc các đầu dò được dán tỷ số bóng đá biotin để lai tại chỗ (ish)

Hóa chất được đề xuất: Bộ dịch Nick, ENZO Chẩn đoán mèo. Số 42803.

Ghi tỷ số bóng đá biotin của plasmid hoặc DNA bộ gen

1. tỷ số bóng đá bị hỗn hợp lai sau đây.

DNTP (bao gồm tỷ số bóng đá-11-DUTP	5 PhaL
DNA plasmid hoặc bộ gen	1 Phag
DNA polymerase I	5 PhaL
dnase I	x
Nước khử ion hoặc cất	Y Muffl
Khối lượng phản ứng tổng số (sử dụng H2o để điều chỉnh tổng thể tích thành 20 PhaL)	31852_31859

1. ủ ống phản ứng trong bể nước ở 14-15 ° C trong 2 h.
2. Dừng phản ứng bằng cách thêm 5 bộ đệm dừng.

Phần quan trọng nhất của việc ghi tỷ số bóng đá, nếu DNA sạch, là kích thước của sản phẩm dịch Nick cuối cùng. Các kết quả ISH tốt nhất thu được khi kích thước của đầu dò có tỷ số bóng đá biotin là khoảng 300-600 bp. Để xác định kích thước của đầu dò, từ chối 15 PhaL của sản phẩm dịch Nick trong nước sôi trong 4 phút, làm mát trên băng ngay lập tức và điện di mẫu trên một minigel với điểm đánh dấu kích thước DNA. Kích thước của sản phẩm dịch Nick có thể được điều chỉnh bằng cách thêm một lượng DNase I khác nhau vào giải pháp phản ứng. Ghi tỷ số bóng đá ngẫu nhiên cũng có thể được sử dụng để ghi tỷ số bóng đá biotin, tuy nhiên kích thước của đầu dò tương đối dễ kiểm soát bởi Nick Dịch.

Tinh chế đầu dò có tỷ số bóng đá biotin

1. 20 phút trước khi kết thúc quá trình ủ Nick-dịch, cắm đáy của ống tiêm tuberculin 1 ml bằng len thủy tinh silicon hóa.
2. Đổ đầy ống tiêm vào đầu với Sephadex G-50 bằng cách sử dụng pipet Pasteur được khử trùng.
3. Đặt ống tiêm chứa đầy Sephadex vào ống lõi 15 ml và máy ly tâm ở 1.500 vòng / phút trong 4 phút để đóng gói Sephadex.
4. Lặp lại hai bước trước cho đến khi cột Sephadex đóng gói có tổng thể tích khoảng 0,9 ml.
5. Wash the colum twice with 55 µL TE by spinning at 1,500 rpm for 4 min each.
6. Đặt một ống 1,5 ml được khử trùng ở dưới cùng của ống Corex 15 ml và chèn ống tiêm được đóng gói và rửa vào ống Corex theo cách mà đầu ống tiêm phù hợp với ống 1,5 ml. Tải sản phẩm dịch Nick (55 PhaL với bộ đệm dừng) và quay ở tốc độ 1.500 vòng / phút trong 4 phút. Đầu tỷ số bóng đá thu thập trong ống 1,5 ml.

Khối lượng cuối cùng của đầu dò phải gần với 55 Laul. Thông thường, 5 PhaL của một đầu dò được gắn tỷ số bóng đá biotin như vậy (1 Phag/55 PhaL = 18 ng/Muffl) là đủ cho một slide và đầu dò có thể được sử dụng để xử lý 100 slide. Kích thước của đầu dò có thể được kiểm tra bằng điện di trên một minigel, trước hoặc sau khi tinh chế màu spin. Đầu dò có thể được lưu trữ trong tủ đông trong vài năm.