bóng đá số

Tiêu hóa DNA

    1. Làm một ly cocktail như sau:
Cocktail lai Nam
10 X bộ đệm
3.50 PhaL
BSA [Stock: 10 mg/ml]
0.35
DDH20
5.65
RNase [Stock: 100 mg/ml]
0,50 ml
ECORI [12 đơn vị/PhaL]
10.00 PhaL
Total
20.00 Pha/ống
  1. Thêm 15 μl [20 Ném25 μg] DNA vào mỗi ống chứa 20 μl cocktail. Pipet nhiều lần để trộn.
  2. ủ các mẫu qua đêm [tối thiểu 10 giờ] trong lò 37 ° C.

Hybridization miền Nam

  1. Gel Stain với 50 μl 10 mg/ml ethidium bromide trong 30 phút và chụp ảnh.
  2. Treat Gel bằng 1 L 0,25m HCl trong 25 phút ở nhiệt độ phòng với lắc nhẹ [màu của bộ đệm tải sẽ trở thành màu vàng sáng].
  3. Rinse gel twice with distilled water and treat with 1 L 0.4M NaOH for 20 min with gentle shaking [The color of the loading buffer will return to blue].
  4. Đổ đầy đĩa thủy tinh với 2 L 0,4m NaOH và đặt một tấm thủy tinh lên trên cùng. Đặt một mảnh giấy sắc ký 3 mm '23 x 30 cm lên trên tấm để các đầu được ngâm trong chất lỏng [‘wick,]. Làm ướt giấy và loại bỏ tất cả các bong bóng không khí bằng cách lăn một pipet thủy tinh lên giấy.
  5. WET Hai '22 .5 x 22,5 cm 'tờ giấy sắc ký với NaOH 0,4m và đặt lên trên tấm bấc. Loại bỏ bong bóng không khí như trong bước 4.
  6. Đặt gel lên bề mặt trên giấy xuống, sau đó đặt một tấm màng nylon lên gel. Cắt gel với kích thước chính xác của màng. Loại bỏ bất kỳ bong bóng khí nào như trong bước 4.
  7. Đặt một dải nhựa giữa hai nửa gel.
  8. WET Hai '10 x 20 cm 'các mảnh giấy sắc ký và đặt trên màng. Loại bỏ bong bóng không khí như trong bước 4.
  9. Bao phủ tất cả các khu vực, ngoại trừ gel, với bọc nhựa để ngăn chặn sự bay hơi và đảm bảo rằng chuyển động mao dẫn chỉ thông qua gel.
  10. Đặt một chồng khăn giấy lớn lên trên khu vực gel. Đặt một tấm thủy tinh lên cả hai chồng khăn giấy và đặt một trọng lượng lên trên đĩa. Hãy để blot ngồi qua đêm [ít nhất 20 giờ].
  11. Màng rửa sạch với 2x SSC trong 5 phút10. Sử dụng ngay lập tức hoặc lưu trữ ướt.

màng chuyển nylon: màng hybond-xL nitrocellulose, danh mục # rpn203s; GE Health, Đại lộ 800 trăm năm, P.O. Hộp 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, Hoa Kỳ; 1-800-526-3593;http: //www5.gelifescates.com.